Τμήμα Μελετών                                                              

Ειδικός Επιστημονικός Σύμβουλος                                              Διευθύνων Σύμβουλος

Εμμ. Γ. Φραγκούλης                                                                           Ε. Φαρμάκης

Ομοτ. Καθηγητής Βιοχημείας, ΕΚΠΑ                                            

Πληροφορίες: Νίκη Μούρτζη, Υπεύθυνη Τμήματος Μοριακής Βιολογίας, τηλ: 210-7783558 (108)

Αδιαμφισβήτητα, η έγκαιρη μοριακή διάγνωση της λοίμωξης από COVID-19 είναι καθοριστικής σημασίας για την ιατρική αντιμετώπιση των ασθενών, την πρόληψη και τον έλεγχο της πανδημίας. Τα τεστ ταχείας ανίχνευσης (rapid tests), των οποίων η αξιοπιστία κυμαίνεται γύρω στο 50% (ανάλογα με την εταιρεία κατασκευής), αποτελούν χρήσιμο εργαλείο για επιδημιολογική μελέτη, κάθε άλλο όμως παρά αξιόπιστα είναι όσον αφορά την ανίχνευση του ιού, ιδιαίτερα όταν το ιϊκό φορτίο είναι χαμηλό (Ct > 30 ).Οι μοριακοί μέθοδοι που στηρίζονται στην μεθοδολογία της Real-Time PCR θεωρούνται παγκοσμίως ως οι πλέον έγκυρες για την ανίχνευση του ιού λόγω της ιδιαίτερα υψηλής ευαισθησίας και ειδικότητας που επιδεικνύουν (>95%).

Ωστόσο, η μέθοδος της Real-Time PCR αποτελεί μια περίπλοκη πειραματική διαδικασία και η αξιοπιστία της εξαρτάται από μια πλειάδα παραμέτρων που θα πρέπει να βελτιστοποιηθούν. Διαφορετικά, αυξάνεται σημαντικά ο κίνδυνος της εμφάνισης ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων, τα οποία συμβάλλουν στην μη έγκαιρη ιατρική περίθαλψη του ασθενούς, αλλά και στη διασπορά του ιού.
Για το λόγο αυτό κρίνεται απαραίτητος ο έλεγχος των εξής:

1. Δειγματοληψία-μεταφορά: Η ακρίβεια της μοριακής εξέτασης εξαρτάται από την ποιότητα του δείγματος που εξετάζεται. Τα κλινικά δείγματα στοματοφαρυγγικού/ρινικού επιχρίσματος των ασθενών πρέπει να λαμβάνονται μόνο από εξιδεικευμένο προσωπικό
το οποίο τηρεί τους κανόνες ασφαλείας και είναι άρτια εκπαιδευμένο σε αυτό. Tα δείγματα COVID-19 θα πρέπει να μεταφέρονται και να διατηρούνται υπό συνθήκες ψύξης (2 – 8 οC) στο εργαστήριο μέχρι να πραγματοποιηθεί ο μοριακός έλεγχος (<12 ώρες), καθώς το RNA είναι ένα πολύ ευαίσθητο μακρομόριο και απαιτεί χαμηλές θερμοκρασίες και την παρουσία αναστολέων ριβονουκλεασών για τη διατήρηση της δομής του και την μη αποικοδόμησή του.
2. Υλικό μεταφοράς-Ρυθμιστικό διάλυμα: Tο ρυθμιστικό διάλυμα στο οποίο τοποθετείται ο στειλεός με το ρινοφαρυγγικό/στοματοφαρυγγικό επίχρισμα του ασθενούς θα πρέπει να περιέχει αναστολείς (ισοθεικοκυανική γουανιδίνη) των ενζύμων που καταλύουν την αποικοδόμηση του RNA δηλαδή των διάφορων ριβονουκλεασών (RNases). Υλικά τα οποία δεν περιέχουν αναστολείς των RNases και τα οποία διατίθενται ευρέως στο εμπόριο, κρίνονται τουλάχιστον ακατάλληλα, καθώς δεν διασφαλίζουν την ακεραιότητα του RNA.
3. Έλεγχος της ποιότητας του RNA: Το εργαστήριο θα πρέπει να ελέγχει περιοδικά την ακεραιότητα του RNA που εκχυλίζεται από τα δείγματα των ασθενών, ώστε να διασφαλίζεται ότι ο μοριακός έλεγχος διενεργείται σε δείγματα RNA υψηλής ποιότητας. Στην προσπάθεια αυτή, το εργαστήριο της Omnimed αξιολογεί συστηματικά την ποιότητα των δειγμάτων RNA με την πλέον έγκυρη μέθοδο της ηλεκτροφόρησής τους στον αναλυτή τελευταίας τεχνολογίας, Tapestation 4150 (Agilent Technologies). Στην Εικόνα παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης RNA δείγματος COVID-19 σε αναλυτή Tapestation 4150 (Αgilent). Διακρίνονται με σαφήνεια οι κορυφές που αντιστοιχούν στην υπομονάδα 28S και 18S του RNA. Ένα τέτοιο RNA κρίνεται ως υψηλής ποιότητας με RIN (RNA Intergrity Number) 8.6, που είναι πολύ κοντά στη βέλτιστη τιμή που χαρακτηρίζει το απόλυτα ακέραιο RNA (RIN = 10).

4. Εσωτερικός μάρτυρας: Η παρουσία γενετικού υλικού στο δείγμα που συλλέχθηκε καθώς και η πειραματική πορεία που ακολουθείται, θα πρέπει να ελέγχεται από την επιτυχή ενίσχυση ενός εσωτερικού μάρτυρα (Internal Control,IC). Ένας τέτοιος μάρτυρας που χρησιμοποιείται είναι το ανθρώπινο γονίδιο αναφοράς της RNase-P. Θετικό σήμα ενίσχυσης του IC αποτελεί ένδειξη επαρκούς ποσότητας γενετικού υλικού στο δείγμα και επιτυχούς RT-PCR αντίδρασης. Δεν πιστοποιεί όμως την ποιότητα του ιϊκού RNA, η οποία θα πρέπει να ελέγχεται με ειδικό σύστημα ηλεκτροφόρησης όπως αναφέρθηκε παραπάνω.

5. Μοναδιαία ανάλυση των δειγμάτων και στάδιο εκχύλισης RNA: Λογικές “pooling”, δηλαδή ανάμειξη δειγμάτων πριν το στάδιο της εκχύλισης του RNA και διενέργεια μοριακής εξέτασης στο συγκερασμένο δείγμα είναι μειωμένης ασφάλειας καθώς μειώνουν σημαντικά την ευαισθησία της εξέτασης και συχνά οδηγούν σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα κλινικών δειγμάτων με χαμηλό ιϊκό φορτίο. Παρομοίως, μεθοδολογίες που παρακάμπτουν το στάδιο απομόνωσης RNA και εφαρμόζουν απευθείας την αντίδραση RT-PCR στο πρωτογενές δείγμα έχουν ελάχιστη αξιοπιστία., καθώς αδυνατούν να ανιχνεύσουν τον ιό σε πρώιμα στάδια της λοίμωξης, όταν υπάρχει δηλαδή χαμηλό ιϊκό φορτίο.

6. Επιλογή του κιτ μοριακής ανίχνευσης COVID-19: Για τη διασφάλιση της ποιότητας της εξέτασης, είναι αναγκαίο να επιλέγονται μόνο κιτ που φέρουν πιστοποίηση CE-IVD. Θα πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψη ο αριθμός των γονιδίων του ιού που ελέγχονται, ιδιαίτερα όσο εμφανίζονται καινούριες μεταλλάξεις, οι οποίες ενδεχομένως να επηρεάζουν την αποδοτικότητα του κιτ, καθώς και στις περιπτώσεις που το ιϊκό φορτίο είναι οριακό. Μετά τον έλεγχο των αποτελεσμάτων 1000 περιστατικών COVID-19, τα οποία κρατούνται στο αρχείο της Omnimed, βρέθηκαν 10 δείγματα τα οποία εμφάνισαν Ct για το γονίδιο Ν του ιού της τάξεως του 35-38, το οποίο ισοδυναμεί με αδιευκρίνιστο/αρνητικό αποτέλεσμα. Όταν όμως πραγματοποιήθηκε έλεγχος των ίδιων 10 δειγμάτων ως προς το γονίδιο S, τότε αυτά εμφάνισαν ιδιαίτερα χαμηλή τιμή Ct (15-23) και σύμφωνα με τις υπάρχουσες οδηγίες, τα δείγματα αυτά θεωρούνται θετικά ως προς την παρουσία του ιού. Συνεπώς, σε περίπτωση που τα εν λόγω δείγματα ελέγχονταν μόνο για τα γονίδια Ε και Ν, θα κρίνονταν εσφαλμένα ως αδιευκρίνιστα ή αρνητικά. Για την αντιμετώπιση αυτού του κινδύνου, στο εργαστήριό μας έχουμε επιλέξει το κιτ Allplex™ 2019-nCoV Master Assay (Seegene Inc.) που επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση 4 γονιδίων του COVID-19 (E,S/RdRp, N), ενώ παράλληλα παρέχει την πληροφορία για την ύπαρξη 4 μεταλλάξεων (HV 69-70 DEL, N501Y, E484K, K417N) στο γονίδιο S του SARS-CoV-2 που έχουν ταυτοποιηθεί σε μεταλλαγμένα στελέχη του ιού, συμπεριλαμβανομένου και του επικρατούς στελέχους  Όμικρον.

7. Εξωτερικός έλεγχος ποιότητας της εξέτασης: Αυτονόητο είναι ότι ο εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος της μοριακής εξέτασης COVID-19 κάθε εργαστηρίου είναι πρωταρχικής σημασίας για τη διασφάλιση της εγκυρότητας των αποτελεσμάτων. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να συμμετέχει περιοδικά σε σχήματα εξωτερικού ποιοτικού ελέγχου, στα οποία καλείται να ελέγξει πρότυπα δείγματα που παραχωρούνται από τον εξωτερικό διοργανωτή των σχημάτων. Μετέπειτα, τα αποτελέσματα συγκρίνονται με αυτά των άλλων εργαστηρίων που συμμετέχουν στον ίδιο κύκλο. Τα αποτελέσματα του τελευταίου κύκλου εξωτερικού ελέγχου ποιότητας που συμμετείχε το εργαστήριο της Omnimed (Οκτώβριος 2021, εταιρεία LabQuality), έδειξε 100% συμφωνία των αποτελεσμάτων με τα αναμενόμενα.

Όλες οι παραπάνω παράμετροι είναι καθοριστικής σημασίας για την  εγκυρότητα της μοριακής εξέτασης COVID-19 και θα πρέπει να λαμβάνονται σοβαρά υπόψιν για τη διασφάλιση υψηλής ποιότητας αποτελεσμάτων.

Νίκη Μούρτζη

Υπεύθυνη Tμήματος Μοριακή Βιολόγος, MSc, Υποψήφια Διδάκτορας, Ιατρική Σχολή Αθηνών